非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法

微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。 當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外， 本法不適用于活菌制劑的檢查。

本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代 方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。

微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)應(yīng)在受控潔凈環(huán)境環(huán)境潔凈度 10 000 級(jí)下的局部潔凈度不 低于 B100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防 止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、 工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的 測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和 劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。

供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使 用中和劑或滅活劑的相容性。

計(jì)數(shù)方法 計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和zui可能數(shù)法（Most-Probable-Number

Method，簡(jiǎn)稱(chēng) MPN 法）。MPN 法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)度較差，但對(duì)于某些微 生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。

供試品檢查時(shí), 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù) 方法，同時(shí)所選的方法的供試品用量必須具備檢測(cè)充足樣品量的能力，能夠以保 證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確 認(rèn)。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。 供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合

于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。

若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用

性試驗(yàn)。

表 1   試驗(yàn)菌液的制備和使用

注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基靈敏度檢查， 檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

菌種及菌液制備

菌種  試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò) 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌

種為第 0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué) 特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見(jiàn)表 1。

菌液制備 按表 1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單 胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物 加入 3～5ml 含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管 內(nèi)，用含 0.05％聚山梨酯 80 的 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯 化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小時(shí)內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在 2～8℃，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使 用。

陰性對(duì)照 為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)以稀釋劑代替供試品進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，

陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。供試品檢查時(shí)也需進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)。如果陰性對(duì)照 有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

培養(yǎng)基適用性檢查 微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行

培養(yǎng)基適用性檢查。

按表 1 規(guī)定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨肉湯管或胰酪大豆胨 瓊脂平板培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基，置表 1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試

驗(yàn)菌株平行制備 2 管或 2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn) 行上述試驗(yàn)。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在 0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基 管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

⒈供試液制備

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液

制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過(guò) 45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn) 用培養(yǎng)基,不得超過(guò) 1 小時(shí)。

常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng) 建立其他適宜的方法。

⑴ 水溶性供試品 取供試品，用 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基溶解或稀釋制成 1:10 供試液。 若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

⑵ 水不溶性非油脂類(lèi)供試品 取供試品，用 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩 沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。 分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如 0.1%的聚山梨酯 80，使 供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時(shí)，用同一稀釋液將 供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。

⑶  油脂類(lèi)供試品  取供試品，加入經(jīng)過(guò)濾除菌的十四烷酸異丙酯使溶解， 或與zui少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯 80 或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活 性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過(guò) 40℃（特殊情況下，zui多不超過(guò) 45℃），小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋劑使成 1∶10 供試液，保溫，混合，并在zui短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用含適宜濃度的無(wú) 菌聚山梨酯 80 或其他無(wú)抑制性無(wú)菌表面活性劑的稀釋劑進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。

⑷需用特殊方法制備供試液的供試品

膜劑供試品  取供試品,剪碎,加 pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制備成 1∶10 的供試液。 若需要，調(diào)節(jié)供試液 pH 值至 6～8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。

腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品，加入 pH6.8 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于 腸溶制劑）或 pH7.6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置 45℃水浴中,振 搖,使溶解,制備成 1∶10 的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。

氣霧劑、噴霧劑供試品  取供試品,置冰凍室冷凍約 1 小時(shí)，取出，迅速消

毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器， 使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無(wú)菌容器中 混合，然后取樣檢查。

貼膏劑供試品 取供試品,去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無(wú)菌玻璃或塑 料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布），避免貼膏 劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山 梨脂 80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少 30 分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液

將供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。

⒉  接種和稀釋 按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加

菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的 1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出， 首先應(yīng)選擇zui低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。

（1） 試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每 1ml 供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于 100cfu。

（2） 供試品對(duì)照組  取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操

作。

（3）菌液對(duì)照組   取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)

組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е?s>所無(wú)法選擇采用zui低稀釋級(jí) 的供試液計(jì)數(shù)方法不能通過(guò)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液 進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用仍無(wú)法以其他方法消 除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng) 性試驗(yàn)。

⒊  抗菌活性的去除或滅活 供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)

組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與小于菌液對(duì)照組的比值不在 0.5-2 范 圍內(nèi)菌數(shù)值的 50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。

⑴  增加稀釋液或培養(yǎng)基體積.

⑵  加入適宜的中和劑或滅活劑。

中和劑或滅活劑（表 2）可用于消除抗菌劑的抑菌活性， 在稀釋劑或

培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組， 即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無(wú)毒 性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在 0.5～2 范圍內(nèi)。

表 2 常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法

⑶  采用薄膜過(guò)濾法。

⑷  上述幾種方法的聯(lián)合使用。 若沒(méi)有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供

試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不可能被該類(lèi)微生物污染。但 是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。 因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果 判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用 性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為zui低稀釋級(jí)的供 試液進(jìn)行供試品檢查。

⒋  供試品中微生物的回收

表 1 所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

微生物的回收可采用平皿計(jì)數(shù)法、薄膜過(guò)濾法或 MPN 法。

⑴ 平皿計(jì)數(shù)法 平皿計(jì)數(shù)法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗(yàn)菌每種 培養(yǎng)基至少制備 2 個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

傾注法   取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消 除”制備的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無(wú)菌平皿中, 注入 15～20ml 溫度不超過(guò) 45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。 同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

涂布法 取 15～20ml 溫度不超過(guò) 45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基，注入直徑 90mm 的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng) 基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平皿表面 接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供 試液不少于 0.1ml。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液 對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

⑵ 薄膜過(guò)濾法 薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45μ m,直徑一 般為 50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí) 應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適 宜的方法滅菌。使用時(shí),應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前 先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類(lèi)供試品,其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分 干燥。為發(fā)揮濾膜的zui大過(guò)濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾 膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為 100ml。總沖洗量不得超過(guò) 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備 的供試液適量（一般取相當(dāng)于 1g、1ml 或 10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌 數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過(guò)濾。用適量的沖 洗液沖洗濾膜。

若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上； 若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)

定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。

⑶  MPN 法  MPN 法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法，尤其 是用于霉菌計(jì)數(shù)，其結(jié)果是不可信的。因此，MPN 法僅在供試品需氧菌總數(shù)沒(méi)有 適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用 MPN 法，按下列步 驟進(jìn)行。

取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備 的供試液至少 3 個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9～ 10ml 胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基 中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。

接種管置 30～35℃培養(yǎng) 3 天，逐日觀(guān)察各管微生物生長(zhǎng)情況。如果由于供 試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基或 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng) 1～2 天，觀(guān)察是否有微生物生長(zhǎng)。 根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表 3 查對(duì)被測(cè)供試品每 1g 或每 1ml 中總需氧菌的zui可 能數(shù)。

表 3 微生物zui可能數(shù)檢索表

注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用 1g（或 ml）、0.1g（或 ml）和 0.01g（或 ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)

相應(yīng)降低 10 倍；如改用 0.01 g（或 ml）、0.001 g（或 ml）和 0.0001 g（或 ml）時(shí)，表 內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低增加 10 倍，其余類(lèi)推。

⒌  結(jié)果判斷 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用薄膜過(guò)濾法或平皿計(jì)數(shù)法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減

去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在 0.5～2 范圍內(nèi)；采 用 MPN 法，試驗(yàn)組菌落數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌落數(shù)的 95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的 回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧 菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

方法適用性確認(rèn)時(shí),若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不 到要求,那么選擇回收zui接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

供試品檢查

檢驗(yàn)量

檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml 或 cm2）。 除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為 10g 或 10ml；膜劑為 100cm2；貴重藥

品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從 2 個(gè)以上zui小包裝單位中抽

取供試品,大蜜丸還不得少于 4 丸,膜劑還不得少于 4 片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。 供試品的檢查 按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵

母菌總數(shù)的測(cè)定。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)

定霉菌和酵母菌總數(shù)。

陰性對(duì)照試驗(yàn)  以稀釋劑代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú) 菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

⒈ 平皿計(jì)數(shù)法 平皿計(jì)數(shù)法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法

適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制 備 2 個(gè)平皿。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)  除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂平板在 30～35℃培養(yǎng) 3-5 天， 沙氏葡萄糖瓊脂平板在 20～25℃培養(yǎng) 5-7 天， 觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況,點(diǎn)計(jì)平板上 生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平皿不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后， 計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè) 平皿的菌落數(shù)平均值不小于 15，則兩個(gè)平皿的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則  需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級(jí)、 霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于 100cfu 的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告

（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取zui高的平均菌落數(shù)，計(jì)算 1g、1ml 或 10cm2 供試 品中所含的微生物數(shù)。

如各稀釋級(jí)的平皿均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅zui低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但 平均菌落數(shù)小于 1 時(shí)，以﹤1 乘以zui低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

⒉  薄膜過(guò)濾法

除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)

于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀 釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過(guò)濾，沖 洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基上培養(yǎng)。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿計(jì)數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不 超過(guò) 100cfu。

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于 1g、1ml 或 10cm2 供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾 膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以﹤1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾 1g、1ml 或 10cm2 供試品）, 或﹤1 乘以zui低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

⒊  MPN 法 取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接

種，所有試驗(yàn)管在 30～35℃培養(yǎng) 3～5 天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按 方法適應(yīng)性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表 3 查對(duì)每 1g 或 1ml 供試品中需氧菌總數(shù)的zui可能數(shù)。

結(jié)果判斷 需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落

數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì) 菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié) 果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù) 測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用 MPN 法，測(cè)定結(jié) 果為需氧菌總數(shù)。

各品種項(xiàng)下要求執(zhí)行規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下： 101cfu：  可接受的zui大限度菌數(shù)為 20；

102cfu：  可接受的zui大限度菌數(shù)為 200；

103cfu：  允許可接受的zui大限度菌數(shù)為 2000：依此類(lèi)推。 若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的

規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品

不符合規(guī)定。

稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基

見(jiàn)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查